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    iTRAQ
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    简介INTRODUCTION

    同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ) 蛋白质组学技术

    Isobaric Tags for Relative andAbsolute Quantization (iTRAQ) proteome technology

    同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(Isobaric tags for Relative andAbsolute Quantitation)技术是由美国应用生物系统公司(Applied BiosystemsIncorporation,ABI)开发的一种多肽体外标记技术。该技术采用了4种( iTRAQ® reagents – 4plex)或8种( iTRAQ® reagents – 8plex )同位素标签,通过标记肽段(Peptide)特异氨基酸位点,然后进行串联质谱分析,可灵活比较最多8种不同样本中蛋白质的相对含量和绝对含量。

    技术原理PRINCIPLE

    iTRAQ实验中,经过蛋白质提取获得组织细胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解(Trypsin Digestion)成肽段,iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记。iTRAQ试剂主要由3部分组成:报告基团(Reportgroup)、平衡基团(Balancegroup)和肽反应基团(Amine-specificreactive group)。以4标试剂为例:报告基团相对分子质量分别为114、115、116和117;平衡基团相对分子质量分别为31、30、29和28,肽反应基团将iTRAQ试剂与肽段上赖氨酸(Lysine,K)及N端氨基酸残基相连,在其上4种报告基团通过平衡基团与反应基团相连,这样就形成了4种相对分子质量均为145的等量异位标签。

    iTRAQ试剂在标记肽段样本后,报告基团和平衡基团的平衡分子量都为145,因此改变任一iTRAQ试剂,不同同位素标记的同一多肽在第一级质谱检测中分子量都完全相同。而在串联质谱(MSMS)中,同重元素标记肽段的报告基团、平衡基团和肽反应基团之间的连接键断裂,平衡基团中性丢失,同时不同同位素标签的同一肽段产生不同的质荷比(114-117)的峰。因此,根据波峰的高度和面积,可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到肽段和蛋白质的定量信息。

    技术特点CHARACTERISTIC

    1.较双向电泳(2D Electrophoresis)优势

    iTRAQ技术不仅可以发现到更多的胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白,同时还可以检测到2D技术较难发现的低丰度蛋白、疏水性蛋白、等电点极酸和极碱蛋白、分子量极低极高蛋白(小于10kDa或大于200KDa)。

    2. 分析时间快、实验误差小

    可在一次实验中同时完成最多8组样本的比较,不仅减少了实验误差和缩短了实验周期,而且增加了实验统计的相关性。

    3. 分析范围广

    iTRAQ试剂几乎可以与样本中所有的蛋白结合,同时因为是体外标记,所以对各种动植物组织、微生物、血液、体液、细胞培养物以及分泌物等样本均可进行分析。

    4. 可信度高

    现代串联质谱具备扫描速度快、精度高等特点,使其二级碎片离子信号增强,产生质量更高的二级质谱,确保鉴定结果高的可信度。同时,标记试剂的报告离子的相对分子质量较低(均不超过121),低分子量区是质谱定性和定量较为准确的区域,因此检测结果更为灵敏可靠。

    5. 翻译后修饰分析

    保留了肽段转录后修饰的状态,因此可对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性和定量研究。

    技术流程PROCESS

    iTRAQ实验流程主要包括:样品蛋白质提取,蛋白质酶解,标记,SCX分级,质谱测试和数据库检索。

    Step 1. 样品蛋白质提取

    因为iTRAQ实验摒弃了2D凝胶实验,通常在2D实验中需要的高浓度的尿素裂解可以不再使用,我们选用了裂解效率更高的SDT裂解液来进行蛋白质提取。在完成制备工作以后,我们会进行1D SDS-PAGE电泳(质控点1)来评判样品的蛋白质是否有降解以及样品之间的平行性如何。

    Step 2. 蛋白质酶解

    我们采用最新的FASP方法进行酶解,酶解肽段我们进行内部的液相-质谱测试,搜库和结果分析。此步为我们的质控点2,主要是评判酶解肽段的平行性和确定物种数据库。

    Step 3. iTRAQ试剂标记

    每份样品的100ug肽段进行iTRAQ试剂的标记。标记完成后,我们进行质控点3,利用MALDI质谱确认iTRAQ的标记效率和平行性。

    Step 4. SCX分析(可选)

    标记好的样品在合并完成之后进行SCX分级。现代质谱在一次实验中已可以同时完成对几千个蛋白质的定性和定量工作。但是在样品中的低丰度蛋白质,比如转录因子等,它们的质谱信号可能会被样品中的高丰度蛋白所掩盖。所以根据Step1和Step2中预备实验结果和前期我们根据文献的指导以决定是否进行SCX分级以及分级的级数。

    Step 5 质谱测试

    SCX分级的样品经过脱盐冻干之后即可上机进行测试。

    Step 6 搜库分析

    质谱原始数据经过专业软件和蛋白质库进行比对分析,得到得到蛋白质的定性和定量信息。

    样本要求REQUIREMENT OF SAMPLE

    样品要求:

    1. 最好送原始样本,除非客户有成熟的蛋白质组学的蛋白提取方法。

    2. 动物组织样品:湿重不少于200 mg,样品不能溶血,取材后用PBS冲洗3遍去除血液。

    3. 植物组织样品:湿重不少于1 g,取材后用PBS冲洗3遍去除杂质污染。

    4. 菌体样品:原则上只接受常见无毒菌的菌体样品,菌体沉淀不少于100 mg或者体积不少于100 μL;若为含有毒菌的菌体样品或菌体  裂解液,按照《病原微生物技术服务操作指南》执行。

    5. 细胞样品:收集细胞沉淀,PBS冲洗3遍,送样量为5×106或细胞沉淀不少于50 μL。

    6. 培养基上清液:需保证无菌体或细胞(用0.2 μm膜过滤),有条件的话可浓缩后再寄送;送样体积不少于10 ml。

    7. 血清样品:新鲜血液取出后,4℃,2000 g,离心15 min,取上清,即得血清;血清制备过程中保证不能溶血;血清体积要求不少于500 μl;制备血清过程中,客户可根据自己的样品和实验要求选择是否添加抗凝剂,一般不用添加。

    8. 若客户直接提供蛋白,则蛋白量不少于1 mg,浓度不低于2 mg/mL。

    送样要求:

    1. 寄送温度

    • a) 胶条样品:冰袋环境;
    • b) 组织、菌体、细胞沉淀、血清、培养基上清和蛋白提取液:样品收集好后立即置于液氮中冷冻5 min,-80℃保存,所有样品收集好后干冰环境寄送;
    • c) 细胞:冻存细胞干冰寄送;培养中的细胞需保证状态良好,培养瓶中装满培养基,常温寄送;

    2. 寄送样品时附上填写完整的纸质版样品信息单(务必包含样品物种拉丁名及数据库、样品标识名称,管数,分组对比信息)。

    3. 样品标记清晰明确,与样品信息单中保持一致,不同项目的样品量参考如下所述。

    FAQFAQ

    1. 关于样品重复的问题?

    最优的实验设计是每组样品设置至少三个生物学重复,比如有A和B两组,最优是提供A1、A2、A3、B1、B2、B3共6个样品;其次是技术重复,只有A和B两个样本,没有生物学重复,推荐做A和B 各3次平行的质谱技术重复。最后是否做生物学重复或者技术重复,还可以有一些其他考虑:如果实验本身在整个研究中处于后期的验证,或者是一个前期的开始,可以考虑1次重复;类似血清或者分泌液的样本也可以做1次重复。无论最后的重复如何设计,一个严谨的设计都需要后期对潜在蛋白质的验证,比如Realtime-PCR,Western-Blot,ELISA等。

    2. iTRAQ实验对样品的要求?

    a.植物类叶片样本:湿重≥1g;

    b.植物富含杂质或蛋白含量低的样本,如植物根,根茎、木质部、韧皮部组织等:干重≥5g;

    c.细胞样本数目须达到:107(建议使用我们的裂解液进行裂解之后再进行寄送);

    d.新鲜人,动物组织:≥100mg;

    e.血清/血浆≥500µl;

    f.尿液≥25mL;

    g.唾液、羊水、脑脊液等体液≥5mL;

    h.其他特殊样本如有疑问请联系我们。

    3. iTRAQ实验一次可以做多少个样本?

    理论上利用一个8标试剂盒,一次实验最多可以做8个样本。但如果在所有的实验里面设置内标的话,就可以把多个8标实验关联起来,这样就可以做超过8个样本的iTRAQ实验了。

    4.通过iTRAQ找到的候选蛋白会与其他蛋白的变化趋势保持一致吗?

    做为一个高通量的实验,iTRAQ最主要的目的是发现一些可能有意义的潜在蛋白,对表型的表现从蛋白的层面上去找一些可能的证据,是一个“发现”过程,需要后期通过其他的实验区再次验证。所以,在一个iTRAQ实验开始之前,我们不会就某个特殊的蛋白质的检出,以及显著性和变化倍数等做出保证。

    5. 为什么要设计预备实验?

    设置预备实验室将整个iTRAQ实验的风险降至最低。通过预备实验结果我们就可以大致判断最后整体实验的情况。比如有些菌类样本,即便在SDS-PAGE图,以及质谱的Basepeak图都是一样的,可以搜完库之后鉴定得到的蛋白质数据会相差比较大,出现这种情况就很有可能是该菌有其他杂菌的污染,如果没有预备实验,这样的情况可能会比较难排查。