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新生DNA的追踪者—BrdU

发布日期:2016-02-15 15:55:22 【关闭】
摘要:Brdu抗体实验

说到标记,大家一定不会忘记老一辈科学家做研究时动不动就借助同(bu)位(pa)素(si), 不管是动植物的营养代谢,微生物的感染增殖,还是蛋白质等大分子的表达与调控,都离不开同位素的帮助。直到后来有了酶和荧光的普及后,同位素才逐渐退出历史舞台。

今天向您介绍的这种物质,在生命科学研究中的标记应用中也扮演着十分重要的角色。 先来看看,它长这样:20160215153350

它就叫BrdU,中文名字叫5-溴脱氧尿嘧啶核苷, English Name5-Bromo-2-deoxyuridine,这货是不是看起来有点眼熟?没错,它和下面这位兄弟长得十分神似:

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没错,这就是胸腺嘧啶核苷(胸苷), DNA的主要零件之一。BrdU和胸苷的结构是如此之像,以至于在养细胞时添加BrdU,或往动物体内注射BrdU时,细胞会傻傻地把它当胸苷利用,而掺入到新合成的DNA链中,当用抗BrdU的抗体检测时,就可以标记出新合成的DNA或反映出产生的细胞来。

根据这一特性,大家把BrdU标记方法发挥得淋漓尽致。稍举几个例子:研究个体发育时,使用BrdU就可以清晰地追踪出每一天新长出的细胞有哪些; 研究干细胞分化时,利用BrdU外加细胞marker,就可以分析出干细胞的分化状况;研究肿瘤侵袭与转移模型时,利用BrdU可以分析出其转移或侵袭的路径;利用BrdU还可以分析创伤的修复或组织的重建情况……

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听起来有些小激动不是? 那么问题来了,这些听上去高上大的实验都是怎么进行的呢?这里就抛砖引玉简单介绍一下最常用的免疫组织化学和免疫荧光步骤。

免疫组化以观察小鼠脾脏细胞增殖为例:

1)第一日向小鼠腹腔或皮下注射BrdU溶液,按50mg/kg剂量注射。(悄悄告诉你,一只6-8周大的Balb/C小鼠大约20-25g重)。 第二日重复一次,第三日放血处死小鼠,取出脾脏。

2)按照IHC的流程固定取下的脾脏,包埋、切片、脱蜡……(此处省略1000字)。

3)将脱蜡水化的片子用纯水洗涤2-3次, 放入2M HCl中浸泡30min 37度)。这一步非常非常重要,因为BrdU掺入到DNA后无法曝露,HCl浸泡可以使DNA解离,从而使BrdU充份暴露出来。尤其要注意的是,实验室用的浓盐酸因为挥发,浓度可能远远低于标称的浓度,所以在使用前需要重新标定浓度。这里提供一个懒人的方法:将浓HCl稀释上百或上千倍后,用pH计测定pH,再通过测得的pH就可以反算出原始的浓度来(不会算的童鞋,赶紧去请教初中化学老师吧,我只能帮您到这儿了)。

4)用足量PBS冲洗切片中和掉残留的HCl,再将其用3%过氧化氢于37度浸泡半小时而破坏内源性过氧化物酶,防止后续产生背景。然后再用BSA封闭。

5)加入抗BrdU的一抗(稀释度参考一抗说明书)。

6)洗涤一抗后加入二抗。

7)洗涤显色,大功告成!

Show一张Proteintech的结果(左边是BrdU处理的,右边是正常脾脏),显棕色信号的细胞就是打BrdU之后新长的啦:

brdu3

 

接下来再看看免疫荧光,以观察HeLa细胞增殖为例:

1)按正常的IF步骤养好细胞,爬片。

2)向培养基里添加BrdU0.03mg/ml左右,替换掉原来的培养基继续培养2小时左右。如果细胞密度不大或想看到更多的细胞可以延长培养时间。

3)用PBS冲洗掉片子上的培养基,乙醇或10%多聚甲醛固定。固定结束后,PBS冲洗之,再放于2M HCl中浸泡30min 37度),这一步与上面免疫组化完全相同,同样地,实验用的HCl需要重新标定

4)用足量的PBS中和掉残留的HCl,再BSA封闭。

5)上一抗,二抗,荧光显微镜下观察……此处再省略1000

还是Proteintech的结果:

brdu4

 

怎么样?看了两个例子,想必您一定融会贯通,玩BrdU于掌股之间了吧。


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本文来自Proteintech微信公众号。